USP <61>: Guia Prático para Contagem Microbiana de Microrganismos Viáveis

Introdução e Escopo da USP <61>

A norma USP <61> estabelece métodos padronizados para enumeração quantitativa de bactérias mesofílicas e fungos que podem crescer sob condições aeróbicas. Estes testes são projetados principalmente para determinar se uma substância ou preparação está em conformidade com especificações estabelecidas para qualidade microbiológica.

Quando Aplicar

O USP <61> aplica-se para determinar a contagem microbiana aeróbica total (TAMC) e contagem total de leveduras e bolores (TYMC) em produtos não estéreis. Os métodos não são aplicáveis a produtos contendo microrganismos viáveis como ingredientes ativos.

Produtos Cobertos pela Norma

• Produtos farmacêuticos não estéreis
• Ingredientes farmacêuticos ativos (IFAs)
• Excipientes e matérias-primas
• Cosméticos e produtos para saúde
• Produtos em forma de aerosol
• Adesivos transdérmicos

Métodos Disponíveis

O USP <61> oferece três abordagens metodológicas:

Filtração por Membrana

Método preferencial para produtos que permitem filtração adequada.

Métodos de Contagem em Placa

• Pour-Plate (Placa de Vazamento)
• Surface-Spread (Espalhamento em Superfície)

Método MPN (Número Mais Provável)

Geralmente o método menos preciso, reservado para grupos específicos de produtos com bioburden muito baixo.

Preparação e Infraestrutura

Condições de Teste

Realize a determinação sob condições projetadas para evitar contaminação microbiana extrínseca do produto a ser examinado. As precauções tomadas para evitar contaminação não devem afetar quaisquer microrganismos que devem ser revelados no teste.

Requisitos de Ambiente

• Áreas controladas para manipulação asséptica
• Cabines de segurança biológica quando aplicável
• Controle de temperatura e umidade
• Acesso restrito com procedimentos de higiene rigorosos

Equipamentos Essenciais

• Incubadoras com controle preciso (20-25°C e 30-35°C)
• Autoclaves para esterilização
• Cabines de fluxo laminar
• Aparatos de filtração por membrana
• Materiais estéreis (placas, pipetas, filtros)

Validação do Método

Teste de Promoção de Crescimento dos Meios

Cada lote de meio preparado deve ser testado inoculando com pequeno número (não mais que 100 UFC) dos microrganismos indicados na tabela oficial:

Microrganismos de Teste Padrão:

• Staphylococcus aureus (ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, ou NBRC 13276)
• Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, ou NBRC 13275)
• Bacillus subtilis (ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62, ou NBRC 3134)
• Candida albicans (ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, ou NBRC 1594)
• Aspergillus niger (ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, ou NBRC 9455)

Adequabilidade do Método na Presença do Produto

A capacidade do teste para detectar microrganismos na presença do produto deve ser estabelecida. Adicione à amostra preparada e a um controle (sem material de teste) volume suficiente da suspensão microbiana para obter inóculo de não mais que 100 UFC.

Controle Negativo

Para verificar as condições de teste, realize controle negativo usando o diluente escolhido no lugar da preparação de teste. Não deve haver crescimento de microrganismos.

Preparação de Amostras

Produtos Solúveis em Água

Dissolva ou dilua (geralmente preparando diluição 1:10) o produto em Solução Tamponada de Cloreto de Sódio-Peptona pH 7,0, Solução Tampão Fosfato pH 7,2, ou Caldo Soja-Caseína Digerida.

Produtos Não Gordurosos Insolúveis em Água

Suspenda o produto (diluição 1:10) nos mesmos diluentes. Agente tensoativo como 1g/L de polissorbato 80 pode ser adicionado para auxiliar a suspensão.

Produtos Gordurosos

Dissolva em miristato de isopropila esterilizado por filtração, ou misture com quantidade mínima necessária de polissorbato 80 estéril aquecido a não mais que 40°C.

Produtos em Aerosol

Transfira assepticamente para aparato de filtro por membrana ou recipiente estéril para amostragem adicional.

Adesivos Transdérmicos

Remova as folhas protetoras e coloque com lado adesivo para cima em bandejas estéreis. Cubra com material poroso estéril e transfira para volume adequado do diluente escolhido.

Neutralização de Atividade Antimicrobiana

Se o produto apresentar atividade antimicrobiana, esta deve ser removida ou neutralizada sempre que possível. Se inibidores forem usados, sua eficácia e ausência de toxicidade para microrganismos devem ser demonstradas.

Agentes Neutralizantes Comuns

Execução dos Métodos

Filtração por Membrana

Use filtros de membrana com tamanho nominal de poro não superior a 0,45 μm. Transfira quantidade adequada da amostra preparada para o filtro de membrana e filtre imediatamente.

Para TAMC: Transfira o filtro para superfície do Ágar Soja-Caseína Digerida Para TYMC: Transfira o filtro para superfície do Ágar Sabouraud Dextrose

Método Pour-Plate

Para placas de Petri de 9 cm de diâmetro, adicione 1 mL da amostra preparada e 15-20 mL de ágar mantido a não mais que 45°C.

Método Surface-Spread

Adicione 15-20 mL de ágar a cada placa e permita solidificar. Espalhe volume medido de não menos que 0,1 mL da amostra sobre a superfície do meio.

Método MPN

Prepare série de pelo menos três diluições decimais seriadas. De cada nível de diluição, use três alíquotas de 1g ou 1mL para inocular três tubos com 9-10 mL de Caldo Soja-Caseína Digerida.

Condições de Incubação

Para Contagem Microbiana Aeróbica Total (TAMC)

• Meio: Ágar Soja-Caseína Digerida
• Temperatura: 30-35°C
• Tempo: 3-5 dias

Para Contagem Total de Leveduras e Bolores (TYMC)

• Meio: Ágar Sabouraud Dextrose
• Temperatura: 20-25°C
• Tempo: 5-7 dias

Interpretação de Resultados

Critérios de Adequabilidade

Para Filtração por Membrana e Métodos de Contagem em Placa: contagem média de qualquer organismo de teste não deve diferir por fator maior que 2 do valor do controle.

Para Método MPN: valor calculado do inóculo deve estar dentro dos limites de confiança de 95% dos resultados obtidos com o controle.

Cálculo de Resultados

TAMC é considerado igual ao número de UFC encontrado usando Ágar Soja-Caseína Digerida. Se colônias de fungos forem detectadas neste meio, são contadas como parte do TAMC.

TYMC é considerado igual ao número de UFC encontrado usando Ágar Sabouraud Dextrose. Se colônias de bactérias forem detectadas neste meio, são contadas como parte do TYMC.

Interpretação de Critérios de Aceitação

Quando critério de aceitação para qualidade microbiológica é prescrito:

• 10¹ UFC: contagem máxima aceitável = 20
• 10² UFC: contagem máxima aceitável = 200
• 10³ UFC: contagem máxima aceitável = 2000

Quantidade de Amostra para Teste

Regra Geral

Use 10g ou 10mL do produto a ser examinado, exceto quando especificado diferentemente.

Casos Especiais

• Aerossóis: Amostrar 10 recipientes
• Adesivos transdérmicos: Amostrar 10 adesivos
• Substâncias ativas ≤1mg por unidade: Teste não menos que a quantidade presente em 10 unidades de dosagem
• Lotes pequenos (<1000mL ou 1000g): Teste 1% do lote
• Lotes com <200 entidades: Reduza para 2 unidades (ou 1 se <100)

Troubleshooting Prático

Problemas Comuns e Soluções

Investigação de Desvios

Falha no controle negativo requer investigação. Implemente sistema CAPA incluindo:

• Análise de causa raiz
• Treinamento adicional quando necessário
• Revisão e ajuste de procedimentos
• Monitoramento de eficácia das ações

Métodos Alternativos

Procedimentos microbiológicos alternativos, incluindo métodos automatizados, podem ser utilizados, desde que sua equivalência ao método farmacopeico tenha sido demonstrada.

Documentação e Rastreabilidade

Registros Essenciais

• Protocolos de validação de métodos
• Registros de execução de testes
• Controles de qualidade dos meios
• Resultados de adequabilidade do método
• Investigações de desvios

Conformidade Regulatória

O USP <61> é reconhecido por agências regulatórias internacionais e deve ser implementado conforme princípios de Boas Práticas de Fabricação (GMP).

Tecnologias Modernas para Análises Microbiológicas

A evolução das análises microbiológicas tem sido impulsionada por avanços tecnológicos que oferecem maior precisão, eficiência e confiabilidade. Laboratórios modernos buscam equipamentos que não apenas atendam aos requisitos normativos, mas também proporcionem otimização de processos e redução de custos operacionais.

Equipamentos para Análises Laboratoriais

O mercado atual oferece diversas soluções tecnológicas que complementam e aprimoram as análises microbiológicas tradicionais:

• Sistemas de análise de viabilidade celular para caracterização avançada de populações microbianas
• Bioprocessadores para cultivo e manutenção de culturas celulares
• Analisadores de TOC para monitoramento de carbono orgânico total
• Equipamentos de análise de partículas para controle ambiental
• Sistemas de potencial zeta para caracterização de superfícies e estabilidade

Integração de Tecnologias

A combinação de diferentes tecnologias analíticas permite abordagens mais abrangentes para controle de qualidade microbiológica, oferecendo dados complementares que enriquecem a compreensão dos processos e produtos analisados.

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